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蛋白质印迹(Western blotting)方法原理和优化(3)

Update:2008-07-22From:ibioo.Com Hot:671

准备蛋白质鉴定膜

干燥

转移完成以后,在继续染色或免疫检测程序之前应将PVDF膜完全干燥。干燥可提高蛋白吸附到PVDF聚合物上的能力,有助于降低随后分析过程中的解吸。印迹膜干燥后就变得不透明了,这种光学变化是一种表面现象,可以掩盖截留在深部孔中的水分,应按照推荐时间干燥印迹膜,以确保所有液体从膜的孔结构中蒸发出来。蛋白转移后干燥的PVDF膜可长时间保存,这对膜没有不利影响(4℃可保存2周,-20℃可保存2个月,-70℃可保存更长时间)。然而,在非控制条件下长期保存可能使有些蛋白对化学变化(如氧化、脱酰胺、水解)敏感。推荐在低温下长期保存。一旦干燥后,在进行任何分析之前,应将膜在100%甲醇中浸泡润湿。

 

蛋白质显像

染色

染色是显示印迹膜上蛋白质的一种简单方法。染色可用于:

验证蛋白质已经转移到膜上

确定各泳道加样量是否相等

评价整体转移效率,尤其是使用新缓冲液系统或蛋白样品时。

有多种染料可以使用,如有机染料(丽春红、酰胺黑、坚牢绿、考马斯亮蓝),荧光染料(荧光胺、香豆素)和胶体微粒(金、银、铜、铁或印度黑墨汁)。这些染料可分为可逆和不可逆染料。通常不可逆染料的灵敏度最佳,但它干扰或无法对蛋白进行进一步分析。不可逆染料的实例有酰胺黑和考马斯亮蓝。可逆染料尽管灵敏度较低,但它允许评估印迹膜后从膜上将其洗除。最常用的可逆蛋白染料是立春红。如果靶蛋白丰度太低,则无法用染色法检测到,但对于较高丰度蛋白,染色法通常可以体现蛋白的转移情况。

用于印迹膜的新荧光染料高度灵敏且可与下游免疫检测、Edman测序和质谱相容。在用显色、荧光或化学发光法进行免疫检测之前,可使用Sypro Ruby和Sypro Rose蛋白印迹染料(分子探针),它们的灵敏度可达约12ng/带。

下表列出检测Western印迹膜上蛋白时最常用的染料:

透视

透视是一种专用于PVDF膜的显像方法,它首先应用于Immobilon-P转印膜。该方法基于一种假设,即转移蛋白覆盖的PVDF膜部分能在20%甲醇中润湿,而周围未结合蛋白的PVDF膜区域则不能。PVDF膜润湿的部分变得可透光,可用背光显示蛋白带并拍照存档。

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